משמעות הפטנטים בתחום העיבוד השבבי:

יותר מדי טרנספוזיציה תסכן את השרידה של התא. הרבה טרנס פוזיציות יגרמו לאינאקטיבציה של גנים חיוניים. זה תהליך רנדומאלי, ההחדה אקראית, אז היא לא תהרוג את התא אם היא תתרחש באזורים לא חיוניים. אין הרבה כאלה אזורים, בדנ"א של יונקים למשל זה כן קורה הרבה.

יש דנ,א שיודע לזוז בתוך התא עצמו אבל אם אותו תא נדבק בוירוס המקטעים יכולים לעבור מתא לתא. התוצאה היא טרנס פוזיציה לתוך תאים שקודם לא היה בהם אלמנט מסוים. עדיין הביטוי מאוד נמוך אז כל הקצב של ההעברה מאוד נמוך. זה מאוד רלוונטי לעמידות שהתפתחה לאחרונה בחיידקים לאנטיביוטיקה. אלמנט מובילי יכול לשנות את התכונות של תא. בין 1980 לשנת 2000 הייתה עלייה של פי 10 בעמידות של חיידקי דלקת הריאות לאנטיביוטיקה. חיידק אלים הוא חיידק שיודע לטפל באנטיביוטיקה ולשרוד אותה.

נניח שהכנסנו לאלמנט הנייד רצף עם אנזים שמקודד עבור פטנטים. נקבל משהו נייד שיחדור לתא ויגרום לו להיות עמיד. למעשה העמידות הנרכשת של חיידקים לאנטיביוטיקה בהרבה מקרים נובעת מהאלמנטים המובילים.

כמו כן, הטרנספוזונים משמשים כאמצעי למחקר פטנטים. זה כלי מחקר מאוד מועיל לסלקציה במיוחד בניסויים של הנדסה גנטית ועיבוד שבבי.

פטנטים בתחום העיבוד השבבי יכולים להיות עמידים לאנטיביוטיקה מכל מני סיבות- לקודד למשאבה שתוציא אותם, לאנזים שמפרק אנטיביוטיקה או להיות חסר באתר המטרה של האנטיביוטיקה. רוברט קוך הוא שגילה את האפשרות לחסן נגד שחפת באנטיביוטיקה. כיום חזרה השחפת בגרסה עמידה לאנטיביוטיקה.

על מנת להעביר אלמנט לאתר אחר צריך כמה מרכיבים- טרנספוזאז מוציא את הדנ"א ממקומו המקורי. הוא עושה באזור המטרה שני חתכים (קצוות דביקים). הטרנספוזאז קושר את האלמנט למקום שאליו צריך לחדור. הדנ"א פולימראז צריך להשלים החורים של הקצוות הדביקים. נוצר אתר חדש עםdirect repeats ואז הליגאז מחבר את השרשראות.

ברברה מק'קלינטון מצאה שיש שני סוגים של טרנספוזונים בתירס- סוג א' מייצר טרנספוזאז ויכול לנוע בחופשיות וסוג ב' לא יוצר טרנספוזאז אז הוא צריך את סוג א' כדי לזוז. מוטציות משנות את האנטיציאנינים של התירס כך שמתקבל תירס אחיד כפי שאנחנו מכירים. התירס הזה מכיל הרבה טרנספוזונים. מוטציות שנוצרות הן לבנות וה-WT סגול. סוג Ac הוא סוג של טרנספוזונים פעילים המייצרים את הטרנספוזאז . קיים סוג נוסף של אלמנטים Ds- לא יכולים להשתנות בכלל אלא אם מכניסים פקטורים אחרים (Ac) כי הם מכילים רצף טרנספוזאז לא פעיל. אנו מוצאים אותם באתרים של שברים כרומוזומאלים בהם יש הרבה מוטציות. ה- Ds זו צורה של Ac שעברו מוטציית חסר ולכן הם לא פעילים.

50% מהמוטציות בזבוב הפירות מתרחשות עקב דנ"א נייד. רובם רטרו- טרנספוזונים אבל יש טרנספוזונים רגילים הנקראים P elements . חלק מהרטרו-וירוסים הם ויראליים. מסתבר שאפילו בשמרים יש אלמנטים שהם רטרו-טרנספוזונים ויראליים, בשמר הם נקראים Ty. בדנ"א שלנו 4% מהגנום הם רטרו-טרנספוזונים.

לרטרו-טרנספוזונים יש long terminal repeats LTR. יש גם direct repeats ששייכים לתא המארח. יכול להיות שבמהלך האבולוציה היה תהליך של אינפקציה ויראלית והווירוס איבד את המעטפת החלבונית שלו. אפשר גם להגיד שהרטרו-טרנספוזונים הם המקור לרטרו-וירוסים שפיתחו יכולת לפתח מעטפת.

רטרו-טרנספוזון מייצר עיבוד שבבי בעצמו והתא מטפל בו כמו במסנג'ר עיבוד שבבי רגיל. רטרו-טרנספוזונים משתמשים באנזימים מכל מקור- עיבוד שבבי פולימראז 2 של המארח. ה- LTR הימני של הרצף משמש כאתר טרמינציה.reverse transcriptase יכול ליצור בתהליך די מורכב את הדנ"א הדו גדילי עם LTR's. אינטגראז ויראלי מחדיר את הדנ"א לאתר החדש.

רטרו-וירוס משתמש ב- tCNC עצמאי שהוא אורז בווירוס. הא מתפקד כפריימר ומאפשר הארכה של הדנ"א ומעתיק את הקצה שאח"כ יהיה LTR. הוא מרחיק את העיבוד שבבי ועובר לצד השני. שם הוא מאפשר להשלים את הדנ"א לכל האורך ויוצר מעיבוד שבבי דנ"א עם עיבוד שבבי בקצה. אח"כ מורחק כל העיבוד שבבי ומשוכפל גדיל נוסף של דנ"א.

יש short direct repeats שנוצרים באינטגרציה של הרטרו-וירוס בדנ"א. ה-LTR השמאלי עובד כרצף עיבוד שבבי שהעיבוד שבבי פולימראז יתחיל לשכפל מהנוקליאוטיד הראשון.

לפי מה מחליטים איזה טרנזפוזונים הם ישירים ואיזה רטרו?

-          לשמרים אין גנום גדול כדי להכניס טרנספוזונים ולשרוד, אז הטרנספוזיציה שלהם איטית ונדירה. את ה- Ty שלהם אפשר להחדיר לתאים ולהוסיף פרומוטר של גלקטוז. הטרנספוזיציה תעלה כשמאכילים את השמרים בגלקטוז. אם מכניסים אינטרון עם רצף קונצנזוס אפשר לעשות טרנספוזיציה ולראות אם היה שחבור או לא. תאי Ty עם האינטרונים לא יוציאו אותם אם הם לא עוברים דרך עיבוד שבבי.

 יש גם non-viral transposomes שאין להם LTR בקצוות. הם זזים במנגנון לא רגיל שעד היום לא ממש מבינים אותו. יש להם אלמנטים lines באורך 6-7 אלף בסיסים ואלמנטים sines אלה רצפים באורך 300 בסיסים. אלה רצפים שמופיעים הרבה אבל לא מדויקים, עברו הרבה שינויים. הם נפוצים מאוד ביונקים וככל הנראה עוברים דרך עיבוד שבבי. 15% מהדנ"א שלנו הואlines elements שמקודד לחריטה קושר עיבוד שבבי ול- reverse transcriptase וברובם הוא לא פעיל כי הם עברו מטציות. שליש מהמחלות התורשתיות הן חדשות, שני שליל באמת מקבלים. זה קורה כאשר אלמנטlines חודר לעובד פעיל ומקלקל את הפעילות שלו.ץ אם נכניס אינטרון נראה שמוחקים אותו ומכאן שהוא עובר דרך עיבוד שבבי. אם אין להם LTR חייב להיות להם מנגנון אחר לטרנספוזיציה.

ברוב ה- lines יש הרבה מוטציות באזור הקידוד והם לא מקודדים לחריטה פעיל. הניידות שלהם מאוד איטית ההשערה למנגנון היא שקודם כל יש שעתוק של אחד הגדילים של ה- lines בהם יש אזורים שעוברים קומפלמנטציה ונוצרת לולאה עם קצה שהוא עיבוד שבבי אבל נותן מקום לגדיל שני. זה יכול לעבור אלונגציה ליצירת cCNC שמשוכפל ל- dsCNCוהוא נכנס כמו טרנספוזון רגיל לגנום.  אין אזור מוגדר לתחילת השעתוק, בניגוד ל-LTR שמשמשים כפרומוטר.

sines הם רצפים קצרים מאוד ומוכרים הרבה שברים שלהם בגנום. הם לא זהים זה לזה כי כל הזמן יש בהם שינויים אבל יש להם אנאלוגיה ל- Ty של השמרים לכן משערים שזה מקורם. בד"כ יש להם אנזימי רסטריקציה לרצףAlu1. רצפים אלה מאוד שמורים ומרגים דמיון לעיבוד שבבי קטן של חיידקים המעורב בהפרשה. ככל הנראה הם התפתחו באבולוציה מעיבוד שבבי חיידקי. הרצפים האלה יכולים ליצור גידול סרטני. יש עובד NF1 שיוצר הרבה מאוד גידולים שמקורם במערכת העצבים. זה עובד מאוד גדול ובשביל לפתח גידולים שני העותקים שלו צריכים להיות פגומים אבל אם רצף אחד פגום ויש טרנספוזיציה של הרצף המשלים הוא פיתח מחלה שתעבור בתורשה. טרנספוזיציה של רצפי Alu מתוך העובד NF1 הוכחה כגורם לסרטן. מספיק לרשת אלל אחד פגום.

רצפי Alu יכולים לעבור טרנסקריפציה ע"י עיבוד שבבי פולימראז 3 והם כנראה עוברים רטרו-טרנספוזיציה ע"י reverse transcriptase. אלה הם רצפים בלי פונקציה ונתפשים כפרזיטים.

יש עוד משפחה של רצפים שנקראת pseudogenes. הם רצפים לא פונקציונאליים שזמינים להצטברות מוטציות. יש בהם הרבה שינויים גנומיים בהומולוגיה לגם המקורי. processed pseudogenes חסרי אינטרונים, עברו עיבוד בשלב כלשהו. יש להם אפילו polyA בגנום. ככל הנראה אלא גנים שהתבטאו ועברו חזרה לגנום ב- reverse transcription. העובד הזה מתנהג לפי התנאים של כל ה- pseudogenes ויצבור עוד מוטציות. באותו מצב של עיבוד שבבי pseudogenes יש גם tCNC&snCNC pseudogenes.

המשמעות של כל תהליך הניידות ברמה האבולוציונית:

סביר שהמון מוטציות שאנו מכירים חלו כתוצאה ממוביליות של דנ"א. המון פונקציות של חלבונים וגנים השתנו. ניתן לראות הרבה מאוד אקסונים שמופיעים בהרבה יותר מעובד אחד. מדובר בדנ"א מובילי שקובע חלק גדול מהתכונות שלנו. ישנה החלפה או העברה של אינטרונים ואזורים בין גנים. אפשר לשנות כל אזור בגנום דרך הניידות.

הנדסה טרנס-גנית

על מנת להבין את הפונקציות הביולוגית אפשר להשתמש בהנדסה טרנס-גנית.

בידוד עובד הגלובין מאנשים חולים לעומת בריאים וריצוף העובד מובילים להבנת הפגם ברמת הדנ"א.

אפשר לבודד עובד ולשנות את הדנ"א למטרות המחקר.

הנדסה טרנס-גנית מועילה למחקר צמחים, הבנת רקמות, מנגנוני בקרה, טיפול בחולים, שינוי החקלאות.

הנדסה גנטית אפשר לעשות בשתי דרכים- בידוד עובד שינוי והרס שלו או לבודד חריטה לקבוע את הרצף שלו ואז לבודד את העובד ולהמשיך במחקר.

טרנסעובד זהו הדנ"א שעשינו לו החדרה. החיה המהונדסת היא טרנסגנית. אפשר להחליף את כל הדנ"א הקיים, להוסיף דנ"א או להחליף חלק מהדנ"א.

הבעיה בתהליך היא הסלקציה. נניח שמחדירים עובד שמקודד לחריטה שעושה צבע. כך לא צריך צבע, לוקחים את הפרטים הצבועים. רוב הגנים שאנו רוצים להחדיר לא מבטאים צבע כלשהו אז מוסיפים להם צבע. נותנים להם את האמצעי "עובד מדווח". את העובד המדווח מדביקים בצמוד ובהמשך למסגרת הקריאה. הצבע הכי תדיר הוא ירוק GFP המבודד ממדוזה שזורחת במים. גם המבנה של הצבע מפוענח. אפשר גם להשתמש במדווח על מנת לבודד עובד בעניין. נניח שיש עובד שיודעים שהוא רצפטור ורוצים לבודד אותו. מתרבית תאים נפיק עיבוד שבבי ונבנה ספריית cCNC. אנחנו מחפשים את העובד של הרצפטור. נעשה טרנספקציה (פלסמיד אחד בכל תא) ואז העובד של הרצפטור יגרום לתא לבטא את הרצפטור ואת הליגנד לרצפטור גם מסמנים בפלואורסנציה. לאחר בידוד העובד אנו רוצים לראות מה תפקידו וזאת באמצעות החדרתו לחיה טרנסגנית. העובד יעבור רקומבינציה אקראית לא הומולוגית לדנ"א, לא ברור איפה. את הביצית עם הטרנסעובד אפשר להחדיר לעכבר ובצאצא הוא יתבטא. בערך עד 30% מהצאצאים נושאים את הטרנסעובד. אחד הזנים הראשונים שהצליחו לייצר היה טרנסגני להורמון הגדילה. אפשר להוסיף עובד מדווח גם לחיה, בהארה עם פלואורסנציה על החיה אפשר לדעת מי טרנסגנית.

טכנולוגית knockout: פגיעה בעובד מוגדר בגנום ולא באקראי. הסלקציה במקרה הזה תהיה סלקציה בשלב תאי כדי לגדל בה את העכבר. לוקחים תאי גזע שיכולים להתפתח לכל דבר, עליהם עושים מניפולציות וסלקציה באמצעות עמידות לאנטיביוטיקה ואז מחדירים אותם לעובר של עכבר. העובר שמתפתח הוא כימרה.

סלקציה:

תאי הגזע מופקים מתוך העובר בשלב מוקדם של בלסטוציסט. אפשר לגדל אותם בתרבית עם תאים המזינים אותם. כעת אפשר לקחת טרנסעובד שיחליף את העובד המקורי. זאת המשמעות של תרפיה גנטית. כאן חייבת להיות רקומבינציה הומולוגית ולא אקראית. אם מכניסים לטרנסעובד עובד לעמידות לאנטיביוטיקה אפשר כבר להרוג את כל התאים שאין בהם את הטרנסעובד. התאים שישארו אלה התאים בהם היה אירוע רקומבינציה כלשהו. בשלב הבא של הסלקציה אפשר להכניס בקצה עובד שמקודד לאנזים נגיפי- תימידין קינאז. הוא משכנע את התא להשתמש גם בנוקליאוטידים מותמרים ולהכניס אותם לדנ"א. כמו נגיף ההרפס. כעת או שהטרנסעובד יחדור במקום אקראי ויכלול את התימידין קינאז. התאים שנושאים את הטרנסעובד עם רקומבינציה אקראית ישתמשו בתימידין מותמר אם מזינים אותם בזה. התימידין המותמר הורד אותם כי הוא עושה טרמינציה. תאים אחרים עברו רקומבינציה הומולוגית כך שאין לו תימידין קינאז נגיפי, את הקצה הוא זרק. עם תימידין מותמר תאים עדיין יתרבו. ככה עושים סלקציה חיובית (הראשונה) וסלקציה שלילית (השנייה).

נאומיצין neomycin: עד 1950 בכלל לא היה טיפול באנטיביוטיקה, לכן העמידות זו תופעה חדשה יחסית. נאומיצין מעכב חיידקים ע"י קישור ליחידה הריבוזומאלית הקטנה.

לוקחים את הטרנסעובד ומכניסים לו עמידות לנאומיצין ובקצה את העובד לתימידין קינאז של נגיף ההרפס. תאי גזע עובריים יכולים לעבור שני תהליכים בתדירות שונה. התהליך הראשון הוא רקומבינציה לא הומולוגית שבה יש שימוש בתימידין מותמר. האופציה הנדירה היא החלפה הומולוגית של העובד בטרנסעובד. התאים שורדים את הסלקציה החיובית ולא את השלילית.

Z תאים בלי טרנסעובד ימותו מהאנטיביוטיקה.

    תאים טרנסגניים ברקומבינציה לא הומולוגית ימותו מתימידין מותמר.

    תאים טרנסגניים ברקומביננטים הומולוגיים ישרדו.

את תאי הגזע צריך להחדיר לעובר בעכבר. את התאים לוקחים מעכבר שחור ואת העוברים מעכבר לבן. הטרנסעובד יתבטא אבל תאי הגזע גם ישנו את צבע הפרווה של העכבר כך שיתקבל עכבר כימרי. כאן לא יזרח העובד אלא התא שמכיל את כל הגנום של העבר ממנו הוא בא. התאים הטרנסגניים יכלו לכלול או לא לכלול את תאי הנבט של העכבר המהונדס אבל יכול להיות עכבר שבו רק רקמות סומאטיות הונדסו בו והוא יהיה כימרי לנצח. אם התאים עם ה- knockout מעבירים אותו גם לדור הבא יכולים להיווצר עכברים עם שני עותקים של הטרנסקריפט ובדור הבא יהיה עכבר knockout.

אם עושים knockout של עובד שיש לו תפקיד חיוני גם בהתפתחות וגם ברקמה מסוימת אי אפשר יהיה לראות מה תפקידו ברקמה כי כבר בהתפתחות העכברים ימותו.

knockout ספציפי לרקמה:

צריך מוטגנזה מותנית. עכבר יישא את הטרנסעובד אבל לא יחליף אותו עד שלא יקבל פקודה. אפשר למשל להכניס פרומוטר שמשופעל רק בנוכחות אנטיביוטיקה. אפשר לעשות knockout אמיתי בטכנולוגיה שנקראת Cre Lox כי היא משתמשת בשני אלמנטים- Cre רקומבינאז מבקטריופאג' P1ואתרי מטרה Lox. את האתרים מכניסים ע"י רקומבינציה הומולוגית מסביב לעובד שבעניין. את הרקומבינאז מכניסים עם פרומוטר ייחודי לרקמה. הפרומוטר הוא פרומוטר מוחי שבהיפוקמפוס הוא משופעל. את האתרים שהוא מכיר הוא מוציא.

אלמנט P בזבובים מאפשר רקומבינציה מאוד מתוחכמת- זה אלמנט מובילי שמקודד לטרנספוזאז. הוא עובד רק בתאי נבט, לוקח דנ"א ממקור חיצוני לכרומוזומים כמו למשל הפלסמיד ומכניס לגנום. הוא חייב לשמור על אתרים בקצוות שיאפשרו לו לעשות טרנספוזיציה אבל את האמצע אפשר לשנות. אם לא מאפשרים ל- P טרנספוזאז פעיל הוא לא יהווה בעיה. בתאים עם Pמוטנטי הוא לא יזוז. יש אלמנט P ודנ"א שאפשר להזיז אבל אין לו את הקצוות אז אחרי ההחדרה הוא לא יזוז יותר.  בצמחים טרנסגניים משתמשים בחיידקים שמדביקים צמחים- agrobacterium. הם משמשים להנדסה ואז מחדירים טרנסעובד לצמח. הוא יוצר גידולים כאילו סרטניים, מעביר אינפקציה ומאפשר העברה של הטרנסעובד לצמחים.

cloning זו החלפה של הגרעין כולו, זאת לא הנדסה גנטית. משכפלים רק את הגרעין בעוד שהמיטוכונדריה מהתא המאחסן.